文/编辑：亨霖研究所

黄瓜是在保护性栽培设施中生长的重要蔬菜作物，它原产于热带地区，被认为是一种冷敏感作物，在一些北方地区，冬季和春季的低温会严重影响设施栽培黄瓜的正常生长，导致产量和质量下降。

嫁接是提高黄瓜产量和抗逆性的重要农艺措施，在过去，黑籽南瓜Bouché因其优越的胁迫耐受性而成为优选的砧木。然而，使用黑籽南瓜作为砧木的Bouché导致嫁接黄瓜果实表面上厚厚的一层花，这最终降低了黄瓜的品质。

近年来，南瓜杜赫已逐渐增加，以改善黄瓜的品质，然而，嫁接的黄瓜南瓜已经发现Duch与嫁接的那些相比具有较低的耐寒性黑籽南瓜布切。

黄瓜果实表面开花的数量与植物吸收和代谢硅的能力有关，硅是植物发育的有益元素，因为它增加黄瓜产量并减轻非生物胁迫的负面影响。推测嫁接黄瓜的耐冷性可能与其对硅的吸收和代谢有关。

目前还不清楚砧木基因型和硅营养在提高黄瓜耐冷性中各自的作用和分子机制有何不同。

植物微小核糖核酸(miRNAs)是长度为21-24个核苷酸(nt)的内源性非编码小核糖核酸，在物种间高度保守，在基因调控中起重要作用。miRNAs可以靶向单个或多个基因来调节植物对胁迫环境的反应。

低温可以改变各种植物中miRNAs的表达，如小麦，拟南芥，和番茄。通过砧木和外源调节miRNAs的表达可以提高植物的抗逆性。这些结果表明，miRNAs在植物对低温胁迫的反应中起着重要的作用。

黄瓜的耐冷性受砧木和硅营养的影响。确定嫁接黄瓜耐冷性变异的主要原因是由于砧木基因型还是硅营养需要更系统和深入的研究。以‘新太蜜刺’黄瓜为试材，配以两种不同砧木:强脱花砧木‘皇城根2号’(南瓜D.)和弱脱花砧木‘云南无花果’(黑籽南瓜B.)作为实验材料。

我们采用高通量测序技术来鉴定在低温胁迫下受砧木和硅调控的miRNAs。我们的目的是从miRNAs的角度研究黄瓜耐冷性改变的原因。

砧木类型和硅营养对黄瓜幼苗耐冷性的影响

测定了5个处理中黄瓜幼苗的生长指数和冷害指数，直观地展示了两种砧木和硅营养在减轻冷害方面的差异，在TC/CC比较组中，低温胁迫抑制了黄瓜的正常生长，并对叶片造成了严重的冷害。

在TS/TC、TH/TC和TY/TC比较对中，施用两种砧木和硅营养减轻了冷害，其中砧木比硅营养更有效。值得注意的是，在砧木中，“云南无花果”表现出最显著的冷害减少。

低温胁迫下砧木和硅调控的差异表达miRNAs

在五个sRNA文库中鉴定了属于26个miRNA家族的64个已知miRNA，在去除每个文库中少于10次阅读的低表达序列用于随后的数据分析后，保留了来自22个miRNA家族的44个已知miRNA。

在这些miRNA家族中，miR156/157、miR159、miR165/miR166、miR168、miR171、miR319、miR390、miR396和miR398具有两个以上的成员。miR171家族拥有5名成员，数量最多。

miRNA家族如miR160、miR162和miR172各只有一个成员。miRNA的表达可以从它们的读数中推断出来。miR159a和miR166a-3p在每个文库中具有超过100，000的阅读量，表明它们被高度表达。

miR390b-3p、miR858a、miR858b和miR2111a-5p的读数在所有五个文库中都小于30，表明它们的表达水平显着较低。最后，根据序列长度对已知的miRNAs进行分类，发现21nt是已知miRNAs的主要长度，占79%。

为了研究低温胁迫下砧木类型和硅营养对miRNA调控的影响，将5个文库分成4个比较对。比较每个比较对中miRNAs的表达，以获得四组差异表达的miRNAs，在TC/CC比较对中，有6个mirna响应低温胁迫。

差异表达miRNAs的靶基因预测和功能分析

我们在四个比较对中鉴定了20个差异表达的mirna，包括7个已知的mirna和13个新的mirna。这些miRNA总共靶向520个基因，每个miRNA的靶基因数量从0到120不等。值得注意的是，miR157d在所有miRNAs中具有最高数量的靶基因。

对这些基因进行GO(基因本体)注释分类分析，在TC/CC、TS/TC、TH/TC和TY/TC比较对中，分别有140、82、219和257个靶基因被分配到GO项。值得注意的是，细胞成分中的“CCAAT-结合因子复合物”和分子功能中的“硫酸盐转运蛋白活性”通常在两种嫁接黄瓜中富集。

与‘皇城根2号’相比，‘云南丝瓜’中发现了一些独特的GO术语，如细胞成分中的‘前核糖体’，‘核仁’，‘含核蛋白复合体’和‘核糖核蛋白复合体’，生物学过程中的‘核糖体生物发生’和‘核糖核蛋白复合体生物发生’。

硅营养调控的miRNAs功能富集过程与其他处理明显不同。在TS/TC比较对中，GO项主要集中在分子功能中的“翻译起始因子活性”上，而生物过程中的“自噬功能”显著丰富。

异表达miRNAs及其靶基因的qRT-PCR验证

随机选择三种已知的miRNAs和三种新的miRNAs，通过qRT-PCR进行定量验证，结果表明，qRT-PCR检测到的miRNAs表达趋势与测序结果一致。miR397a的表达在低温下下调。

在低温胁迫下，“云南丝瓜”上调其表达，而“皇城根2号”和硅营养无显著影响。novel-mir46的表达受低温胁迫和两种砧木的抑制，但外源硅上调其表达。我们通过qRT-PCR定量了差异表达的miRNAs的6个靶基因，以探索miRNAs和靶基因之间的调控关系。

miRNAs通过负调控来调节目的基因的表达。例如，低温下调miR397a，上调其靶基因的表达。qRT-PCR和高通量测序鉴定的miRNAs表达模式一致，表明测序结果的可靠性。

植物可以通过介导miRNAs来调节与耐冷性相关的基因的表达，以应对冷害，不同脱花能力的砧木和外源硅对黄瓜幼苗耐冷性的影响差异显著。试图鉴定低温下受两种砧木和硅营养调控的miRNAs，并分析它们在调节黄瓜幼苗耐冷性中的作用。

黄瓜幼苗miRNAs对低温胁迫的响应

在黄瓜幼苗中鉴定了6个响应低温胁迫的mirna，miR157d是与棉花发育相关的关键miRNA，上调的miR157可以抑制组织细胞增殖和细胞膨胀。在这项研究中，低温胁迫上调了miR157d，它被预测针对各种基因，包括鳞目动物-启动子结合蛋白基因家族。

富含亮氨酸重复受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BAM1,阳离子氨基酸转运蛋白8,短链脱氢酶TIC32和富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子和声压级必需转录因子与花器官发育相关。

CAT8通过调节液泡内外的氨基酸含量，在维持细胞内氨基酸稳态中发挥重要作用。RSZ22是人类的同源基因SRSF7因子并可能参与前mRNA剪接，TIC32是叶绿体生物发生的主要部分。黄瓜幼苗可能通过改变miR157d的表达来控制叶片细胞的生长以应对低温胁迫。

miR397可以调节漆酶、POD和L-抗坏血酸氧化酶的表达，或者直接靶向CBF表达诱导物1(ICE1)调节脑血流量基因，从而参与植物对低温胁迫的反应，然而，miR397响应低温胁迫的表达模式因物种而异。在低温胁迫下，miR397在小麦中的表达减少，但在拟南芥中的表达增加。

我们观察到低温胁迫抑制了黄瓜幼苗中miR397a的表达，LAC4,LAC11,LAC17和败育小孢子(AMS)被预测为miR397a的主要靶基因。一些研究表明，抑制基因的表达LAC4和LAC17可显著降低木质素含量，导致植物对低温胁迫的耐受性显著降低。

miR398是一种高度保守的miRNA，它通过调节c铜/锌超氧化物歧化酶(CSD1和CSD2)在植物。miR398a-3p受到低温胁迫的抑制，CSD可以增强ROS清除系统，促进植物对低温胁迫的反应。

两种砧木影响的与耐冷性相关的miRNAs

嫁接是提高黄瓜耐冷性的重要农艺措施。与自根黄瓜相比，在‘皇城根2号’嫁接黄瓜和‘云南无花果’嫁接黄瓜中的miRNAs差异分析分别鉴定出8个和11个不同的miRNAs。miR395a和miR398a-3p是在两种类型的嫁接黄瓜中发现的相同的miRNAs。

miR395通过调节硫酸盐代谢在植物对盐和干旱胁迫的响应中起着至关重要的作用，miR395在植物中的表达可以在低温胁迫下发生改变。砧木促进了低温胁迫下黄瓜嫁接苗miR395a的表达。

miR395a被预测为目标硫酸盐转运相关蛋白质低亲和力硫酸盐转运蛋白3(SUT3),叶绿体ATP硫酸化酶1(APS1)和硫酸盐转运蛋白2.1(SUT21)参与植物中的硫酸盐运输。mir395a被预测为靶向赤霉素调节蛋白1(GASA1)，它通过调节赤霉素信号传导参与植物对非生物胁迫的反应。

硅营养对幼苗耐冷性的影响

们从TC/TS比较对中确定了6个显著差异表达的miRNAs对硅的反应，其中包括2个已知的mirna(mir168a-5p和miR390a-5p)和4个新的mirna(novel-mir26，novel-mir55，novel-mir67，novel-mir70)。

miR168受干旱和低温等非生物胁迫诱导，通过靶向间接调节其他miRNAs的功能argonaute1(AGO1)，miR168a的上调可提高植物对干旱胁迫的耐受性，miR168a的启动子区含有可能参与ABA信号通路的ABA顺式作用元件。

在这项研究中，硅上调miR168a-5p，并预测其靶向性AGO1。AGO1与miRNAs结合形成RNA诱导沉默复合物(RISC),参与靶RNA切割并介导转录后基因沉默。

预测了4种新的mirna(novel-mir26、novel-mir55、novel-mir67和novel-mir70)对外源性硅有反应，novel-mir26对硅和两种砧木都有反应，并被预测为靶向晚期胚胎发生丰富蛋白34(LEA34)和富含半胱氨酸的受体样蛋白激酶10(CRK10)。

LEA34和CRK10可能参与细胞内ROS清除、蛋白质保护和ABA信号传导71].在低温胁迫下，硅降低了novel-mir55和novel-mir70的表达。扩张蛋白A23(EXPA23)。EXPA23是膨胀蛋白超家族的成员，它破坏细胞壁多糖之间的非共价键，并导致响应各种非生物胁迫的胁迫依赖性细胞膨胀。

过度表达EXPA8-B和EXPA8-D已经显示提高了拟南芥的耐寒性，在低温胁迫下，novel-mir70被外源硅上调，并被预测为靶向转录因子GTE12。虽然已经在拟南芥中发现了12种GTE蛋白，但是它们的功能还不清楚。

我们利用高通量测序技术鉴定了黄瓜幼苗中响应低温、外源硅和两种砧木的miRNAs。在TC/CC、TH/TC和TY/TC比较对中观察到了novel-mir46和miR398a-3p，表明这些miRNAs不仅对低温胁迫作出反应，而且对砧木也作出反应。

我们在TC/CC和TS/TC比较对中没有发现相同的miRNAs，novel-mir38、novel-mir65、novel-mir78和miR397a的差异表达可能是导致两种砧木嫁接黄瓜耐冷性差异的重要因素。

这些miRNAs的鉴定有助于我们了解不同脱花能力砧木之间在缓解低温胁迫分子机制上的差异，这对于后续研究提高嫁接黄瓜的耐冷性是至关重要的。